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一、原理

DNA在堿性的溶液中帶有負電荷,因此,在電場作用下朝正極移動。在瓊脂糖凝膠中電泳時,由于瓊脂糖凝膠具有一定孔徑,長度不同的DNA分子由于所受凝膠的阻遏作用大小不一,遷移的速度不同,從而可以按照分子量大小得到有效分離。溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中。在紫外光的照射下,插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色熒光,所以溴化乙錠可以作熒光指示劑指示DNA含量和位置。

二、材料、儀器設備及試劑

(一)材料:分子量不同的DNA片段。

(二)儀器設備:1. 電泳儀;2. 紫外檢測儀;3. 水平電泳槽;4. 移液器;5. 一次性手套。

(三)試劑:1. pH8.3 Tris-硼酸-EDTA緩沖液:稱取10.78gTris,5.500g硼酸,0.930gEDTA-Na2溶于無離子水,定容到100ml,用時稀釋10倍;2. EB溶液:溴化乙錠(10mg/ml)(用時稀釋10倍);3. 加樣緩沖液:50%甘油+0.25%溴酚藍;4. 瓊脂糖。

 三、實驗步驟

(一)瓊脂糖凝膠的制備:

1. 稱取瓊脂糖1g,加入10倍電泳緩沖液10ml,再加入蒸餾水90ml,在電爐上加熱溶解,配制成1%瓊脂糖凝膠;稍涼后加入配好的EB溶液數滴。

2. 將電泳模板兩端密封,倒入瓊脂糖凝膠溶液,插入梳子。

3. 冷凝后將梳子撥出,電泳膠放入電泳槽中。

(二)加樣:取樣品溶液20μl,加入1/5體積加樣緩沖液,混勻后,將溶液加到樣品孔中,同時在另一樣品孔中加入標準分子量DNA。一般DNA樣品*好控制在0.5~1.0μg之間。

(三)電泳:加入pH8.3Tris-硼酸-EDTA緩沖液,通電維持2~4V/cm,電泳至溴酚藍走到膠底部邊緣時停止電泳。

(四)染色及觀察:電泳完畢,取出凝膠模具,將其推到一塊干凈的玻璃板上,于254nm或300nm波長紫外燈下觀察,DNA存在的位置呈現橙黃色熒光,放置時間超過4~6h后熒光減弱,因此應立即用用國產全色膠卷拍照,并應加上紅色濾色鏡。

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